原子力显微镜（AFM）

一、测试原理

扫描透射电子显微镜（STEM）只能在真空条件下表征样品的微观结构，因此水凝胶必须经过脱水处理，所得到的结果并不是水凝胶的真实结构。相比之下，原子力显微镜（AFM）可以对样品的表面形貌、弹性模量、形变等进行表征，且能够在溶液、大气、真空多种环境下工作，适合用来原位表征水凝胶的结构。此外，也可应用于DNA、蛋白质和细胞表面分子的结构观察。

AFM的工作原理是在工作期间探针与待测样品间产生微弱斥力，探针在样本表面移动时，该斥力可使探针在样品的表面方向垂直起伏运动，利用光学检测法收集探针扫描高度的位置变化，从而可以获得样品表面的信息，生成样本的三维形貌图像。

二、测试模式

根据AFM探针与样品之间作用力的不同可将AFM的扫描模式分为三类：接触式、非接触式以及轻敲模式。

2.1 接触式

在接触模式下，探针针尖由于与样品接触而受到排斥力的作用，排斥力会导致微悬臂发生偏转，这一偏转可以通过光学探测器来获得。并且如果已知悬臂的刚度，则可以通过胡克定律来确定针尖-样品间力的大小。在接触成像的过程中，通过仪器软件调整预设成像力的值，使得在整个扫描过程中悬臂维持小而固定的弯曲量，这样就可以获得样品表面高精度的形貌图像。一般在接触模式下，形貌图像的垂直分辨率可以达到小于0.1 nm（低至0.01 nm），横向分辨率可以达到约0.2 nm的程度。但接触模式也存在一些不足，例如当它在研究质地较软的样品时，由于探针在扫描过程中始终与样品保持接触，可能会使样品产生变形，破坏样品表面以及造成针尖磨损等。

2.2 非接触式

在非接触式工作模式下，探针在离样品一定距离处进行振荡扫描，由于针尖没有和样品发生接触，因而探针施加在样品上的力非常低，这导致样品的变形和剪切非常小，避免了针尖的损坏和样品的损伤。但由于针尖和样品间的距离较大，因此分辨率比接触式的低。到目前为止，非接触模式通常不适合在液体中成像，在生物样品的研究中也不常见。

2.3 轻敲模式

在轻敲模式（Tapping Mode，TM）中，探针受到固定端压电驱动器的激励进行高频振动，使得针尖与样品表面间歇性的接触。此时探测器通过收集微悬臂自由端的响应信号可以绘制形貌图和相位图。由于探针间歇性的接触样品表面，因此轻敲模式在保持高分辨率图像质量的同时消除了剪切力对样品的破坏，这意味着它可以对柔软，易损及黏附性强的样品进行成像而不会因剪切力的作用产生严重的变形或损伤，同时也可以在水下检测。总之，TM-AFM通过减少针尖与样品之间的相互作用力，实现了对软样品的高分辨率成像，同时降低了对样品的损坏，这使得轻敲模式成为研究低弹性模量样品时的一种理想选择。

三、轻敲模式下的成像方式

在TM-AFM中，形貌像和相位像是两种基本的成像方式。形貌像的形成是通过维持探针振幅恒定来检测样品表面地形的变化，而相位像的形成则与针尖-样品间的能量耗散有关，是通过测量悬臂驱动压电的振荡与检测到的振荡之间的相位差而得到的，然后根据刚度和粘弹性等图像特性得到图像对比度。形貌图仅提供样品表面形貌变化的信息，不能确定样品表面的性质。而相位图来研究样品区域性质的变化具有一定的优越性，如图1所示，其中高相位角的亮区对应模量较高的区域，低相角的暗区对应模量较低的区域。相位图可以在纳米尺度上得到样品表面局域性质的大量信息，如黏附性、弹性、黏弹性、刚度和化学结构。

图1 石墨烯层的纳米分辨率结构的原子力显微镜表征，其中图（a-c）为形貌图像，图（d-f）为相位图像^[7]

四、峰值力轻敲模式

峰值力轻敲模式（PeakForce Tapping Mode）是Bruker公司的独家核心技术。其原理是采用2 kHz的固定频率在样品表面的每一个像素处做一次力曲线。做力曲线的过程中，探针施加给样品的力的最大值称为峰值力（Peak force），利用峰值力做反馈，通过扫描管的移动来保持探针和样品之间的峰值力恒定，从而反映出样品的形貌。与轻敲模式相比，峰值力轻敲模式的悬臂共振频率只有2 kHz，且探针和样品之间的作用力可控（小至pN），因此分辨率更高。

定量纳米力学分析（QNM）是峰值力轻敲模式的一个重要应用，在对样品表面形貌进行高分辨率成像的同时还可以对材料进行纳米尺度的力学分析，通过力-位移曲线可以得到杨氏模量、粘附力、能量耗散和最大形变量等信息。如下图2所示。

图2 水凝胶杨氏模量分布和局部放大图

由于QNM表面形貌成像中分辨率有限，因此可以使用相位图来表征水凝胶的微观结构。如图3，是在峰值力轻敲模式下得到的相位图，其中高相位角的亮区对应模量较高的区域，低相角的暗区对应模量较低的区域。

图3 不同配比水凝胶的AFM相位图像

五、AFM样品制备要点

由于AFM是纳米级别的表征手段，如果样品表面起伏较大，可能探测不到部分样品表面从而无法得到真实的形貌，因此样品的表面应尽可能光滑。样品需要固定到基底上，基底应清洁无尘，如果样品未固定好，在测试过程中出现移位等情况，会导致图像异常或者无法扫描出数据。

常用的样品固定方法有用胶固定和静电吸附：常规样品一般用胶将样品粘到基底上，导电实验可使用银胶。如果是液下成像模式需要注意，所使用的胶不能在该液体环境中发生溶解。带负电的DNA样品则可通过静电吸附作用固定到带正电的云母片上；除此之外，还可以通过探针修饰。制样的基底可选用云母片、玻璃片、抛光硅片、石墨、石英片等，其中最常用的是新剥离的云母片（使用前剥离最表面一层）和硅片（需双面抛光、超声清洗），利用电性能测试时需要导电性能良好的载体，如石墨或镀有金属的基片。